Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti. Bilten RGMU - Bilten RGMU - arhiva. Tekst znanstvenog rada na temu "Kemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu"

1 Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Savezna državna proračunska ustanova “Centar za kemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju “Orlovsky”

3 Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državno sveučilište - obrazovni, istraživački i proizvodni kompleks"

Istraživana je mogućnost korištenja kemiluminiscencije za procjenu antioksidativnog djelovanja hranjivim tvarima. Predložena metoda temelji se na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, čiji intenzitet ovisi o količini peroksida u kemiluminiscentnom uzorku. Kemiluminiscencija je zabilježena pomoću razvijene instalacije koja sadrži pumpu za doziranje, svjetlosnu komoru, stakleni vakuumski fotomultiplikator i računalni sustav. Kako bi se pojačala kemiluminiscencija, luminolu je dodana otopina kalijevog željeznog sulfida. Promjene intenziteta kemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po svom visokom antioksidativnom djelovanju. Utvrđeno je da se kemiluminiscencijskom metodom mogu odrediti antioksidativna svojstva različitih prehrambenih spojeva.

Istraživana je mogućnost korištenja kemiluminiscencije za procjenu antioksidativnog djelovanja hranjivih tvari. Predložena metoda temelji se na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, čiji intenzitet ovisi o količini peroksida u kemiluminiscentnom uzorku. Kemiluminiscencija je zabilježena pomoću razvijene instalacije koja sadrži pumpu za doziranje, svjetlosnu komoru, stakleni vakuumski fotomultiplikator i računalni sustav. Kako bi se pojačala kemiluminiscencija, luminolu je dodana otopina kalijevog željeznog sulfida. Promjene intenziteta kemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po svom visokom antioksidativnom djelovanju. Utvrđeno je da se kemiluminiscencijskom metodom mogu odrediti antioksidativna svojstva različitih prehrambenih spojeva.

Bibliografska poveznica

1 Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Oryol State Institute of Economics and Trade"

2 Savezna državna proračunska ustanova “Centar za kemikalizaciju i poljoprivrednu radiologiju “Orlovsky”

3 Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Državno sveučilište - obrazovni, istraživački i proizvodni kompleks"

Istraživana je mogućnost korištenja kemiluminiscencije za procjenu antioksidativnog djelovanja hranjivih tvari. Predložena metoda temelji se na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, čiji intenzitet ovisi o količini peroksida u kemiluminiscentnom uzorku. Kemiluminiscencija je zabilježena pomoću razvijene instalacije koja sadrži pumpu za doziranje, svjetlosnu komoru, stakleni vakuumski fotomultiplikator i računalni sustav. Kako bi se pojačala kemiluminiscencija, luminolu je dodana otopina kalijevog željeznog sulfida. Promjene intenziteta kemiluminiscencije zabilježene su u trenutku unošenja analiziranog uzorka u otopinu luminola. Kao analizirani uzorak korišten je ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom. Sadrži fenolne spojeve poznate po svom visokom antioksidativnom djelovanju. Utvrđeno je da se kemiluminiscencijskom metodom mogu odrediti antioksidativna svojstva različitih prehrambenih spojeva.

kemiluminiscencija

antioksidativno djelovanje

peroksidi

hranjivim tvarima

1. Vasiljev R.F. Kemijski sjaj // Kemija i kemičari, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (datum pristupa: 22.08.13.).

2. Vladimirov Yu.A. Slobodni radikali i antioksidansi // Vestn. RAMS. – 1998. – br. 7. – str. 43–51.

3. Kondrashova E.A. Kemiluminiscencija kao najosjetljivija metoda enzimskog imunotestiranja i njezina primjena // Klinička laboratorijska dijagnostika. – 1999. – br. 9. – str. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Kemiluminiscentna analiza // Imunologija. – 1991. – br. 1. – str. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktivna kemiluminiscencija u sustavu fagocitoze // Microbiology. – 1987. – br. 1. – str. 109–115.

6. Sherstnev M.P. O kalciju ovisni i o kalciju neovisni putovi za stvaranje stanične kemiluminiscencije // Pitanja kemiluminiscencije. – 1991. – br. 2. – str. 1–4.

Danas kemiluminiscencija predstavlja veliko znanstveno područje koje se nalazi na granici između kemije, fizike i biologije. Kod kemiluminiscencije dolazi do izravne pretvorbe kemijske energije u energiju elektromagnetskih vibracija, tj. u svijet Pomoću kemiluminiscencije možete saznati kako se odvija reakcija, koji je njen mehanizam, što je potrebno za učinkovito i učinkovito provođenje tehnoloških procesa. Ako tehnološki proces primanje bilo koje kemijski proizvod je popraćen kemiluminiscencijom, njezin intenzitet može poslužiti kao mjera brzine procesa: što se brže odvija reakcija, to je sjaj jači. Tijekom reakcije kemiluminiscencije nastaju produkti bogati energijom, koji zatim emitiranjem svjetlosti oslobađaju energiju, odnosno kemijska energija se pretvara u energiju elektromagnetskog zračenja.

Svrha studije je istražiti mogućnost korištenja kemiluminiscencije za procjenu antioksidativnog djelovanja hranjivih tvari.

Rezultati istraživanja i rasprava

Problem procjene antioksidativne aktivnosti hranjivih tvari vrlo je relevantan. Korištenje izraza "antioksidativna aktivnost" da bi se pokazala korisnost određenog proizvoda često se izvodi bez ikakve kemijske ili biokemijske argumentacije. U pravilu, antioksidativna aktivnost bilo koje tvari znači učinkovitost smanjenja peroksidnog broja. Sam koncept peroksidnog broja također ne otkriva u potpunosti njegovu kemijsku bit, jer ne odgovara u potpunosti kinetici i termodinamici faza metabolizma jednog ili drugog prehrambeni proizvod. Osim toga, ova se vrijednost koristi za karakterizaciju lipida u obliku masti. Međutim, procesi oksidacije i stvaranja peroksida u tijelu ne događaju se samo pri konzumiranju masti, već i drugih namirnica. Drugim riječima, može se reći da je sadržaj peroksida u određenom proizvodu "izvagan" na nekoj vrsti vage, gdje je "referentna težina" jedinica koncentracije jodidnog iona oksidiranog peroksidima u kiseloj sredini, kao rezultat čega nastaje molekularni jod:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Kada se molekularni jod titrira otopinom koja sadrži natrijev tiosulfat, utvrđuje se njegova koncentracija i stoga se određuje količina oksidirajućih jodidnih iona, tj. peroksidni spojevi, što se zapravo naziva peroksidni broj. Određivanje peroksidnog broja pomoću ove vrste "vaganja" temelji se na reakciji prikazanoj na Sl. 1.

Riža. 1. Određivanje peroksidnog broja natrijevim tiosulfatom

Dakle, koncentracija peroksida određena je iz jednadžbe

S(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

gdje je ϒ korelacijski koeficijent između koncentracije molekulskog joda i koncentracije peroksida.

Predložena metoda za određivanje peroksida u proizvodima temelji se na kemiluminiscenciji luminola (C[lm]) u alkalnom mediju, čiji intenzitet (Ichl) ovisi o koncentraciji peroksida (C[-O-O-]) u kemiluminiscentnom uzorak:

IHL = Ϧhl ω, (4)

gdje je Ϧhl kvantni prinos kemiluminiscencije; ω - brzina reakcije koja uključuje perokside:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

gdje je khl konstanta brzine reakcije ili pri:

C[lm] khl Ϧkhl = K, (6)

IHL = K C[ -O-O-]. (7).

Količina peroksida (-O-O-) određena je sumom svjetlosti (S):

Vrijednost S ovisi o stupnju potpunog utroška peroksida u kemiluminiscentnoj reakciji.

Za određivanje konstante K konstruira se kalibracijska krivulja za ovisnost sume svjetlosti S o koncentraciji peroksida, koja se utvrđuje titracijom:

S = f(C[-O-O-]). (9)

Vodikov peroksid H2O2 koristi se kao peroksid.

Zatim se uspoređuju podaci dobiveni iz jednadžbe (3) i (9). Na temelju usporedbe ϒ i K, zaključuje se o slaganju reakcijskih mehanizama koji su u osnovi određivanja peroksida ovim metodama. Otkriveno je da se u ovom rasponu koncentracija peroksida ϒ i K zapravo međusobno slažu i stoga se mogu koristiti za određivanje peroksidnog broja.

Kemiluminiscencija je opažena u alkalnom mediju koji je sadržavao luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, H2L). Snimljeno je korištenjem kemiluminiscentnog uređaja uključujući stakleni vakuumski fotomultiplikator. Fotomultiplikator se napaja preko visokonaponskog ispravljača (7) spojenog na blok (9) koji pojačava signal fotomultiplikatora koji se snima na zaslonu monitora računala (5).

Riža. 2. Registracija kemiluminiscencije analiziranog proizvoda: 1 - pumpa za doziranje; 2 - svjetlootporna komora; 3 - ogledalo; 4 - kiveta; 5 - računalni sustav; 6 - fotomultiplikator; 7 - visokonaponski ispravljač; 8 - uređaj koji vam omogućuje određivanje spektralnog područja kemiluminiscentnog zračenja; 9 - blok koji pojačava signal fotomultiplikatora

Za uvođenje analiziranog uzorka u kivetu (4) koja sadrži kemiluminiscentnu otopinu luminola potrebna je pumpa za doziranje (1). Ovaj dozator djeluje kao miješalica za ubrizgani uzorak s kemiluminescentnom otopinom. Kako bi se povećala brzina reakcije i intenzitet kemiluminiscencije, luminolu je dodana otopina kalijevog željeznog sulfida. Miješanje se vrši pomoću mjehurića zraka dobivenih pumpanjem zraka kroz tekućinu otopine. Zrcalo (3) smješteno u svjetlopropusnoj komori (2) služi za bolje prikupljanje svjetlosti kemiluminiscentnog zračenja koje pada na fotokatodu fotomultiplikatora (6) ugrađenog u svjetlopropusnu komoru. Dozator vam omogućuje uvođenje potrebnih tekućih komponenti u kivetu bez otvaranja komore nepropusne za svjetlo (2) tijekom pokusa. U ovom slučaju te tekućine ulaze u kivetu (4) kroz staklene ili plastične cijevi. Računalni sustav omogućuje snimanje ovisnosti intenziteta sjaja I o vremenu t, odnosno kinetike kemiluminiscencije:

Računalni sustav odražava konstante porasta i pada u funkciji I = f(t), koje su povezane s konstantama brzine reakcija koje uzrokuju kemiluminiscenciju, odnosno s njihovom kinetikom. U kemiluminiscentnu komoru uključen je uređaj (8) koji omogućuje određivanje spektralnog područja kemiluminiscentnog zračenja, odnosno ovisnost:

I = f1(λ). (jedanaest)

Ovaj blok je kazeta u obliku diska u koju su ugrađeni granični filtri. Zamjena filtara provodi se rotiranjem disk kasete u odnosu na vodoravnu os koja povezuje središta ravnine filtara i ravnine fotokatode fotomultiplikatora.

Proces mjerenja provodi se na sljedeći način:

1. Utvrđuje se reakcija fotomultiplikatora na promjene njegovog napona napajanja i na promjene intenziteta referentnog izvora svjetlosti koja pada na njegovu katodu.

2. Kiveta se napuni otopinom luminola u lužnatom mediju.

3. Dozator se napuni analiziranim uzorkom.

4. Snima se ovisnost intenziteta kemiluminiscencije o vremenu t. Promatranja kemiluminiscencije provode se do vremena t1, u kojem je promjena I1 od vremena t minimalna: I1 = f1(t).

5. Dio analizirane otopine isporučuje se pomoću dozatora.

6. Promatra se kemiluminiscencija analiziranog uzorka čija je kinetika I = f(t).

Na sl. Na slici 3 prikazan je graf ovisnosti funkcija (I1 = f1(t)), pridruženih grafu (I = f(t)), nakon uvođenja analizirane otopine.

Kao što se može vidjeti sa Sl. 3, intenzitet kemiluminiscencije luminola se mijenja: nakon naglog porasta slijedi nagli pad luminiscencije nakon dodavanja analiziranog uzorka.

Budući da je povećanje kemiluminiscencije tijekom oksidacije luminola povezano s stvaranjem peroksida, smanjenje intenziteta kemiluminiscencije nakon uvođenja analiziranog uzorka ukazuje na smanjenje njihove količine. Posljedično, može se govoriti o prisutnosti antioksidativnog djelovanja u spojevima uključenim u analizirani uzorak.

Valja napomenuti da je analizirani uzorak bio ekstrakt maslačka dobiven suhom niskotemperaturnom destilacijom, koji sadrži fenolne spojeve poznate po visokom antioksidativnom djelovanju.

Riža. 3. Grafikon ovisnosti o funkciji (I1 = f1(t)), spojen s grafom (I = f(t)), nakon uvođenja analizirane otopine

Osim toga, eksperimentom je utvrđeno da je kemiluminiscencijom moguće odrediti količinu peroksida u ultrarazrijeđenim sustavima, što je važno za procjenu početka oksidacije proizvoda, primjerice, tijekom skladištenja.

Stoga su studije pokazale da metoda za određivanje peroksida u proizvodima, koja se temelji na kemiluminiscenciji luminola u alkalnom mediju, omogućuje procjenu antioksidativne aktivnosti prehrambenih tvari i može se koristiti za utvrđivanje antioksidativnih svojstava različitih prehrambenih spojeva. .

Recenzenti:

Litvinova E.V., doktor tehničkih znanosti, profesor Odsjeka za tehnologiju, organizaciju i higijenu hrane, Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "OrelGIET", Orel;

Kovaleva O.A., doktorica bioloških znanosti, ravnateljica Instituta, Savezna državna proračunska obrazovna ustanova visokog stručnog obrazovanja "Oryol State Agrarian University", Orel.

Rad je zaprimljen u urednici 08.11.2013.

Bibliografska poveznica

Ključne riječi

anotacija znanstveni članak o kemijskim znanostima, autor znanstvenog rada - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu Izmailov, Yu

Ljekovite biljne sirovine jedan su od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama određivanja sadržaja antioksidansa u biljnim objektima raširena je metoda kemiluminiscencijske analize. U ovom radu korišten je za procjenu ukupni antioksidativni kapacitet(OAE) dekocije plodova rowan, šipka i gloga i infuzija plodova maline. U eksperimentu je zabilježena kinetika kemiluminiscencija u sustavu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola. Koncentracije i volumen komponenti sustava u uzorku odabrani su tako da jaki antioksidansi ( askorbinska kiselina) i antioksidansi srednje jakosti (quercetin) potpuno su oksidirani tijekom vremena mjerenja (10 min). Predložena je i obrazložena metoda za izračun OAE na temelju promjena sume svjetlosti kemiluminiscencija u prisustvu biljnih uzoraka. Kinetička analiza kemiluminiscencija pokazalo je da u proučavanim objektima dominiraju antioksidansi srednje jakosti, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol, itd.). Usporedba izračunatih OAE vrijednosti za proučavane objekte i podataka njihove kemijske analize pokazala je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima prema vrsti mogu razlikovati u svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Povezane teme znanstveni radovi u kemijskim znanostima, autor znanstvenog rada - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu Izmailov, Yu

• 2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.

• Određivanje antioksidansa aktiviranom kemiluminiscencijom pomoću 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana)

  2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Antioksidativni učinak dihidrokvercetina i rutina u peroksidaznim reakcijama kataliziranim citokromom c

  2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.

• Procjena oksidativnog i antioksidativnog kapaciteta bioloških supstrata kemiluminiscencijom induciranom Fentonovom reakcijom

  2016 / Piskarev Igor Mikhailovich, I.P. Ivanova

• Određivanje sadržaja lipohidroperoksida u serumskim lipoproteinima sustavom mikroperoksidaza-luminol

  2011 / Teselkin Jurij Olegovič, Babenkova Irina Vladimirovna

• Metode istraživanja antioksidansa

  2004 / Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V.

• Antioksidativno djelovanje biljaka koje se koriste u etnomedicini Tuve

  2012. / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.

• Proučavanje antioksidativnih svojstava Fosprenila u različitim biološkim testnim sustavima

  2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu Sanina, A. D. Agafonova

• Utjecaj različitih doza polikloriranih bifenila na stanje spontane i imunoglobulinom izazvane luminol-ovisne kemiluminiscencije pune krvi

  2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samokhodova O.V.

• Evaluacija sustava lipidne peroksidacije antioksidativne zaštite u djece s esencijalnom arterijskom hipertenzijom spektrofotometrijskim i kemiluminiscencijskim metodama

  2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Kemiluminiscentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta ljekovitog biljnog materijala

Ljekoviti biljni materijal jedan je od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Kemiluminiscencijska analiza jedna je od uobičajenih metoda određivanja sadržaja antioksidansa u biljnom materijalu. U našem radu korištena je kemiluminiscencijska analiza za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TAC) voćnih dekokata planinskog jasena, ruže i gloga, kao i infuzije plodova maline. Pokusima je utvrđena kinetika kemiluminiscencije sustava koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola. Koncentracije i volumeni komponenti sustava odabrani su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i antioksidansi srednje snage (kvercetin) potpuno oksidirani tijekom mjerenja (10 minuta). Predložena je i potkrijepljena metoda za izračun TAC-a temeljena na promjenama sume svjetlosti kemiluminiscencije u prisutnosti biljnih uzoraka. Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima dominiraju antioksidansi srednje snage, uključujući flavonoide i slabe antioksidanse (tokoferol i dr.). Usporedba izračunatih TAC vrijednosti za objekte koji se proučavaju i podataka njihove kemijske analize pokazala je da proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima antioksidansa po vrstama mogu varirati u svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnih učinaka slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih vrsta antioksidansa.

Tekst znanstvenog rada na temu “Kemiluminiscentna metoda određivanja ukupnog antioksidativnog kapaciteta ljekovitog bilja”

kemiluminiscentna metoda za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu Izmailov1, Yu A. Vladimirov1

1 Zavod za medicinsku biofiziku, Fakultet fundamentalne medicine, Moskva Državno sveučilište nazvan po M.V.Lomonosovu, Moskva

2 Zavod za farmakognoziju Farmaceutskog fakulteta,

Prva moskovska država medicinsko sveučilište nazvan po I. M. Sechenovu, Moskva

Ljekovite biljne sirovine jedan su od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Među metodama određivanja sadržaja antioksidansa u biljnim objektima raširena je metoda kemiluminiscencijske analize. U ovom radu korišten je za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TAC) dekocija plodova oskoruše, šipka i gloga te infuzije plodova maline. U eksperimentu je snimljena kinetika kemiluminiscencije u sustavu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola. Koncentracije i volumen komponenti sustava u uzorku odabrani su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i umjereni antioksidansi (kvercetin) potpuno oksidirani tijekom vremena mjerenja (10 min). Predložena je i opravdana metoda za izračunavanje OAE na temelju promjena svjetlosne sume kemiluminiscencije u prisutnosti biljnih uzoraka. Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima prevladavaju antioksidansi srednje jačine, uključujući flavonoide, i slabi antioksidansi (tokoferol i dr.). Usporedba izračunatih OAE vrijednosti za proučavane objekte i podataka njihove kemijske analize pokazala je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima prema vrsti mogu razlikovati u svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnog djelovanja slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu antioksidansa različitih vrsta.

Ključne riječi: slobodni radikali, antioksidans, antioksidativno djelovanje, ukupni antioksidativni kapacitet, kemiluminiscencija, luminol

Financiranje: rad je podržala Ruska znanstvena zaklada, grant br. 14-15-00375.

Ex3 Za dopisivanje: Georgij Konstantinovič Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovski prospekt, 31, zgrada 5; [e-mail zaštićen]

Članak primljen: 10.03.2016. Članak prihvaćen za objavu: 18.03.2016.

kemiluminescentno određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta u ljekovitom biljnom materijalu

1 Zavod za medicinsku biofiziku, Fakultet fundamentalne medicine, Moskovsko državno sveučilište Lomonosov, Moskva, Rusija

2 Zavod za farmakognoziju Farmaceutskog fakulteta,

Prvo Moskovsko državno medicinsko sveučilište Sechenov, Moskva, Rusija

Ljekoviti biljni materijal jedan je od izvora antioksidansa za ljudski organizam. Kemiluminiscencijska analiza jedna je od uobičajenih metoda određivanja sadržaja antioksidansa u biljnom materijalu. U našem radu korištena je kemiluminiscencijska analiza za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta (TAC) voćnih dekokata planinskog jasena, ruže i gloga, kao i infuzije plodova maline. Pokusima je utvrđena kinetika kemiluminiscencije sustava koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola. Koncentracije i volumeni komponenti sustava odabrani su tako da su jaki antioksidansi (askorbinska kiselina) i antioksidansi srednje snage (kvercetin) potpuno oksidirani tijekom mjerenja (10 minuta). Predložena je i potkrijepljena metoda za izračun TAC-a temeljena na promjenama sume svjetlosti kemiluminiscencije u prisutnosti biljnih uzoraka. Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da u ispitivanim objektima dominiraju antioksidansi srednje snage, uključujući flavonoide i slabe antioksidanse (tokoferol i dr.). Usporedba izračunatih TAC vrijednosti za objekte koji se proučavaju i podataka njihove kemijske analize pokazala je da proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima antioksidansa po vrstama mogu varirati u svojoj sposobnosti zaštite tijela od štetnih učinaka slobodnih radikala. . Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih vrsta antioksidansa.

Ključne riječi: slobodni radikali, antioksidans, antioksidativno djelovanje, ukupni antioksidativni kapacitet, kemiluminiscencija, luminol

Financiranje: ovaj rad je podržala Ruska znanstvena zaklada, grant br. 14-15-00375.

Zahvale: autori zahvaljuju Andreyu Alekseevu s Moskovskog državnog sveučilišta Lomonosov na pomoći u provođenju eksperimenta. Adresa za dopisivanje: Georgiy Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, k. 5, Moskva, Rusija, 119192; [e-mail zaštićen] Primljeno: 10.03.2016. Prihvaćeno: 18.03.2016.

Slobodni radikali formirani u tijelu remete strukturu staničnih membrana, što zauzvrat dovodi do razvoja različitih patoloških stanja. Destruktivno oksidativno djelovanje radikala sprječava antioksidativni obrambeni sustav organizma u kojem važnu ulogu imaju niskomolekularni spojevi – presretači radikala (zamke). Jedan od izvora antioksidansa su ljekovite biljne sirovine, kao i lijekovi na njihovoj osnovi, čije proučavanje antioksidativnog potencijala pomaže u povećanju njihovog preventivnog i terapeutskog učinka.

U radovima se raspravlja o glavnim metodama određivanja antioksidansa, ali definicija antioksidansa kao kemijski spojevi ne daje potpunu sliku zaštitnih svojstava predmeta koji se proučava: ona su određena ne samo količinom jednog ili drugog antioksidansa, već i aktivnošću svakog od njih. Antioksidativna aktivnost ili antioksidacijska aktivnost, AOA, konstanta je brzine reakcije antioksidansa sa slobodnim radikalom (kInH). Metoda kemiluminiscencije (CL) omogućuje određivanje ukupne količine radikala koji vežu antioksidanse u uzorku (total antioxidant capacity, TCA), a metodom matematičkog modeliranja kinetike CL i brzinu stvaranja i reakcije radikala s antioksidansima, odnosno AOA.

Najčešća modifikacija kemiluminiscencijske metode za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta temelji se na upotrebi luminola kao aktivatora kemiluminiscencije. Uzorak s dodatkom luminola, vodikovog peroksida i spoja koji može stvarati radikale kao rezultat spontane razgradnje (termolize), na primjer 2,2"-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorida (ABAP):

U prisutnosti molekulskog kisika, alkilni radikal R^ tvori peroksilni radikal ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Iz LH, stvaranjem intermedijarnih tvari (luminol hidroperoksida i luminol endoperoksida), nastaje u elektronski pobuđenom stanju molekula konačnog produkta oksidacije luminola, aminoftalne kiseline, koja emitira foton. , a kao rezultat se opaža kemiluminiscencija . Intenzitet CL-a proporcionalan je brzini proizvodnje fotona, a ona je pak proporcionalna stacionarnoj koncentraciji LH u sustavu. Interakcijama s radikalima antioksidansi prekidaju opisani lanac transformacija i sprječavaju nastanak fotona.

Spojevi podložni termolizi nisu jedini mogući izvor radikala pri analizi antioksidativnog kapaciteta uzorka kemiluminiscentnom metodom. Alternative su peroksidaza hrena-vodikov peroksid, hemin-vodikov peroksid, citokrom c-kardiolipin-vodikov peroksid, itd. Reakcijska shema za oksidaciju luminola pomoću peroksidaza raspravlja se u radu Cormiera i sur. .

Kinetičke krivulje CL za ove sustave odražavaju dvije faze reakcije: fazu povećanja intenziteta CL i fazu platoa ili postupnog opadanja luminiscencije, kada

Intenzitet CL je ili konstantan ili polako opada. U radu su opisana dva pristupa mjerenju ukupnog antioksidativnog kapaciteta koji uzimaju u obzir ovu značajku krivulja. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) temelji se na mjerenju latentnog razdoblja CL t i može se koristiti za određivanje antioksidansa kao što su Trolox ili askorbinska kiselina: karakterizira ih visoka konstanta brzine reakcije s radikalima i zbog toga se mogu nazivaju jakim antioksidansima . Tijekom latentnog razdoblja dolazi do njihove potpune oksidacije. TAR (Total Antioxidant Reactivity) metoda mjeri stupanj gašenja kemiluminiscencije q na platou ili maksimumu kemiluminiscentne krivulje:

gdje je I intenzitet kemiluminiscencije bez antioksidansa, a 11 je intenzitet CL u prisutnosti antioksidansa. Ova metoda se koristi ako sustav sadrži pretežno slabe antioksidanse s niskim konstantama brzine interakcije s radikalima - puno nižim u usporedbi s konstantom luminola.

Učinak antioksidansa karakteriziraju ne samo pokazatelji t i c. Kao što se može vidjeti iz radova, učinak antioksidansa poput mokraćne kiseline u hemin-H2O2-luminol sustavu ili tokoferola, rutina i kvercetina u citokrom c-kardiolipin-H2O2-luminol sustavu karakterizira promjena maksimalne brzine povećanja CL (utx). Kao što pokazuju rezultati matematičkog modeliranja kinetike, vrijednosti konstanti brzine interakcije ovih antioksidansa s radikalima bliske su vrijednosti konstante luminola, stoga se takvi antioksidansi mogu nazvati antioksidansima srednje jakosti.

Ako bi materijal koji se proučava, posebice biljne sirovine, sadržavao samo jednu vrstu antioksidansa, tada bi se njihov sadržaj mogao karakterizirati jednim od tri gore navedena pokazatelja (t, c ili V). Ali biljni materijali sadrže mješavinu antioksidansa različite jačine. Da bi riješili ovaj problem, neki su autori koristili promjenu svjetlosne sume kemiluminiscencije tijekom određenog vremena DE, izračunatu formulom

DE = DE0 - DE,

gdje su DE0 i DE5 svjetlosne sume CL za određeno vrijeme? u kontrolnom odnosno ispitnom uzorku. Vrijeme mora biti dovoljno da oksidiraju svi antioksidansi u sustavu, odnosno da CL krivulja ispitnog uzorka dosegne razinu CL krivulje kontrolnog uzorka. Potonji pretpostavlja da istraživači moraju ne samo zabilježiti svjetlosnu sumu sjaja, već i zabilježiti kinetičku krivulju CL-a dovoljno dugo, što nije uvijek učinjeno.

Budući da svi mjereni parametri ovise o uređaju i uvjetima mjerenja, antioksidativni učinak tvari u sustavu koji se proučava obično se uspoređuje s učinkom standardnog antioksidansa, primjerice Troloxa.

Mnogi su autori koristili sustav peroksidaza hrena-vodikov peroksid za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih materijala. Za procjenu količine antioksidansa u uzorcima korišten je latentni period CL (TRAP metoda), au radu je korištena površina ispod krivulje razvoja CL. No, navedeni radovi ne daju jasno opravdanje

izbor jednog ili drugog parametra za procjenu OAU.

Svrha istraživanja bila je utvrditi kako omjer različitih vrsta antioksidansa utječe na TOA, te modificirati metodu kemiluminiscencije na način da se točnije odredi TOA u biljnom materijalu. Da bismo to učinili, postavili smo si nekoliko zadataka. Prvo, usporedite CL kinetiku proučavanih objekata s kinetikom standardnih antioksidansa tri vrste (jaki, srednji i slabi) kako biste razumjeli koji tip antioksidansa daje glavni doprinos OAU proučavanih objekata. Drugo, izračunajte OAE objekata koji se proučavaju mjerenjem smanjenja sume svjetla CL pod utjecajem tih objekata u usporedbi s učinkom antioksidansa koji daje najveći doprinos OAE.

MATERIJALI I METODE

Predmet istraživanja bili su industrijski uzorci gloga, borovca ​​i šipka koje proizvodi JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), kao i plodovi malina koje su autori sakupili u moskovskoj regiji u prirodnim uvjetima rasta i osušeni na temperaturi od 60-80 ° C. C dok ne prestanu ispuštati sok i deformirati se pri pritisku.

Reagensi za analizu antioksidativnog kapaciteta kemiluminiscentnom metodom bili su: KH2PO4, 20 mM otopina pufera (pH 7,4); peroksidaza iz korijena hrena (aktivnost 112 jedinica/mg, M = 44173,9), 1 mM vodena otopina; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, M = 177,11), 1 mM vodena otopina; vodikov peroksid (H2O2, M = 34,01), 1 mM vodena otopina; otopine antioksidansa (askorbinska kiselina, kvercetin, tokoferol). Sve reagense proizvodi Sigma Aldrich (SAD).

Uvarci od plodova gloga, rowan i šipka i infuzija plodova maline pripremljeni su prema metodama Državne farmakopeje SSSR-a, navedenim u općem farmakopejskom članku "Infuzije i dekocije".

Određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta provedeno je snimanjem kemiluminiscencije na kemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) pomoću softvera PowerGraph 3.3. Za određivanje OAE u biljnom materijalu potrebno je 40 μl luminola u koncentraciji od 1 mM, 40 μl peroksidaze hrena u koncentraciji od 0,1 μM, od 10 do 50 μl dekokta ili infuza (ovisno o koncentraciji) i fosfatni pufer u Potrebna količina stavljena je u kivetu uređaja da bi se ukupni volumen uzorka doveo do 1 ml. Kiveta je postavljena u uređaj i CL je snimljen, promatrajući pozadinski signal. Nakon 48 s snimanja pozadinskog signala, u kivetu je dodano 100 μl H2O2 u koncentraciji od 1 mM i CL snimanje je nastavljeno 10 minuta. Pripremljena su četiri uzorka s različitim koncentracijama svakog biljnog objekta. CL je također zabilježen za otopine askorbinske kiseline, kvercetina i tokoferola u pet različitih koncentracija za svaki od antioksidansa. Naknadno je OAU uzoraka dekocija i infuzija preračunat u kvercetin.

Koncentracije luminola, peroksidaze hrena i vodikovog peroksida odabrane su tako da se odredi antioksidativni kapacitet vodenih ekstrakata ljekovitog bilja u prihvatljivom vremenu (ne dužem od 10 min). Tijekom tog vremena krivulje kemiluminiscencije za antioksidanse askorbat i flavonoid kvercetin (glavni antioksidansi biljnih materijala)

dostigao plato, što ukazuje na potpuno uništenje antioksidansa u sustavu. Razrjeđenja ispitivanih uzoraka i koncentracije otopina standardnih antioksidansa (naznačenih u naslovima slika) odabrane su na način da su sve CL kinetičke krivulje mjerene pri istoj osjetljivosti uređaja.

Antioksidativni kapacitet izračunat je iz promjene površine (AS) ispod kinetičke krivulje kemiluminiscencije (zbroj svjetlosti) nakon dodatka tvari koja sadrži antioksidans. Da bismo to učinili, izračunali smo S0 za sustav bez antioksidansa i od njega oduzeli površinu SS, koja karakterizira sustav u koji je dodan antioksidans. Vrijednost AS ovisi o osjetljivosti kemiluminometra i uvjetima mjerenja. Omjer AS/C ■ V (gdje je C koncentracija ispitivanog biološkog materijala u kiveti, g/l, a V volumen kivete, l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g ispitivanog materijala, tj. biljne sirovine.

Na sličan način smo izračunali antioksidativni kapacitet ASa otopine standardnog antioksidansa, npr. kvercetina, stavljenog u isti volumen reakcijske smjese. Omjer AS/CÄ ■ V (gdje je CA težinska koncentracija antioksidansa u kiveti, g/l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g antioksidansa.

Za svaki od standardnih antioksidansa zabilježen je signal iz otopina nekoliko koncentracija kako bi se osiguralo da su izračuni unutar linearnog odnosa i da su dobiveni rezultati ponovljivi. Doista, dobivena je linearna ovisnost (ASa = kA ■ CA) signala o koncentraciji, iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent kA. Prema Fisherovom kriteriju, kA vrijednosti dobivene za standardne antioksidanse su statistički značajne s vjerojatnošću od 0,975. Zatim je zabilježen signal iz četiri koncentracije za svaki od četiri biljna uzorka, te za sve uzorke koje smo dobili linearna ovisnost signal koncentracije (AS = k ■ C), iz kojeg je izračunat stehiometrijski koeficijent k. Uz vjerojatnost od 0,975 (Fisherov test), k vrijednosti dobivene za uzorke biljaka su statistički značajne. Ukupni antioksidativni kapacitet biljnog materijala u odnosu na masu standardnog antioksidansa (mg%) određen je pomoću formule

OAE = k ■ 105. k

Vrijednosti su predstavljene kao aritmetička sredina ± standardna devijacija (M ± 5) na p<0,05.

REZULTATI ISTRAŽIVANJA

Studija kinetike kemiluminiscencije u prisutnosti natrijevog askorbata (slika 1) pokazala je da ovaj antioksidans karakterizira latentno razdoblje kada je CL gotovo potpuno potisnut. Njegovo trajanje proporcionalno je količini antioksidansa u sustavu. U tom slučaju ne mijenja se ni nagib CL krivulja ni intenzitet CL na platou. To se objašnjava činjenicom da je askorbinska kiselina jak antioksidans koji presreće sve radikale nastale u sustavu, uključujući i luminol radikale, a CL se ne razvija dok sav askorbat ne oksidira.

Učinak tokoferola (slika 2) očitovao se smanjenjem intenziteta CL na platou, što je tipično za slabe antioksidanse, iako se tokoferol smatra jednim od najjačih antioksidansa.

snažni antioksidansi. Možda je ovo odstupanje posljedica činjenice da su u našem eksperimentu slobodni radikali bili u vodenoj otopini, dok se učinak tokoferola obično proučava u nepolarnom mediju. U istraživanju gdje je izvor radikala bio kompleks citokroma c s kardiolipinom, a reakcija s luminolom odvijala se unutar tog kompleksa, tokoferol je imao svojstva antioksidansa srednje jakosti.

Proučavajući učinak različitih koncentracija kvercetina na naš sustav (slika 3) i uspoređujući kinetičke krivulje za njega i natrijev askorbat i tokoferol, može se uočiti da se glavni učinak kvercetina očituje u promjeni nagiba kvercetina. krivulje, tj. brzina razvoja CL, što je tipično za antioksidanse srednje jakosti.

Krivulje CL za sve ispitivane dekokcije (slika 4) nalikuju krivuljama za kvercetin s blagim smanjenjem intenziteta CL na kraju, tj. kada se postigne

Vrijeme, min

Riža. 1. Učinak natrijevog askorbata na kinetiku kemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sustava: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,05 uM; 3 - 0,10 uM; 4 - 0,15 uM; 5 - 0,2 uM; 6 - 0,25 µM natrijevog askorbata.

plato. Kao što je prikazano u radu, ovakvo ponašanje je tipično za antioksidanse srednje jakosti, koji u našem slučaju uključuju polifenole - flavonoide i tanine. Za infuziju plodova maline (slika 4, D) primjetno je smanjenje kemiluminiscencije na razini platoa, što je tipično za slabe antioksidanse, što je u ovom slučaju tokoferol. Što se tiče kvercetina i tokoferola, infuzija maline sadrži 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetina i 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferola.

Usporedbom krivulja kemiluminiscencije dobivenih za različite koncentracije četiri ispitivana vodena ekstrakta iz biljnih materijala, pokazalo se da je doprinos srednjih i slabih antioksidansa ukupnom antioksidativnom kapacitetu uzoraka smanjen u sljedećim serijama: infuzija plodova maline (slika 4.). , D), uvarak od šipka (slika 4, B), uvarak od plodova rowan (slika 4, A), uvarak od plodova gloga (slika 4, B). Vrijednosti AS temeljene na koncentraciji C ispitivane tvari u kiveti i vrijednosti ukupnog antioksidativnog kapaciteta u smislu kvercetina dane su u tablici.

RASPRAVA REZULTATA

Podaci dobiveni tijekom pokusa i na temelju njih izračunate OAE vrijednosti proučavanih objekata uspoređeni su sa sadržajem glavnih antioksidansa u njima, određenim kemijskim metodama analize. Unatoč činjenici da je pozitivna korelacija između ukupne količine antioksidansa i TAU u različitim objektima neosporna, ipak postoje primjetne razlike između ovih pokazatelja. Na primjer, ako uzmemo zbroj sadržaja flavonoida, tanina i askorbinske kiseline, tada se ispostavlja da je veći od izračunatog TAU za sve ispitivane objekte, osim za dekokciju plodova gloga (tablica).

Drugi su istraživači također pokazali da se rezultati kemijske analize i TAU vrijednosti određene kemiluminiscentnom metodom često ne poklapaju. Tijekom rada, ukupni antioksidativni kapacitet, određen

46 Vrijeme, min

Ja" "h chi----.

Riža. 2. Učinak tokoferola na kinetiku kemiluminiscencije

Koncentracije komponenti sustava: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,01 uM; 3 - 0,025 uM; 4 - 0,06 uM; 5 - 0,1 uM; 6 - 0,2 µM tokoferola.

46 Vrijeme, min

Riža. 3. Utjecaj kvercetina na kinetiku kemiluminiscencije. Koncentracije komponenti sustava: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,02 uM; 3 - 0,03 uM; 4 - 0,04 uM; 5 - 0,05 uM; 6 - 0,06 µM kvercetina.

Vrijeme, min

46 Vrijeme, min

46 Vrijeme, min

120 I 100 80\60 40 20

46 Vrijeme, min

Riža. 4. Učinak dekocija plodova oskoruše (A), gloga (B), šipka (C) i infuzije plodova maline (D) na kinetiku kemiluminiscencije komponenti sustava: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. (A) Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l izvarak plodova rowan. (B) Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l uvarak plodova gloga. (B) Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l uvarak od šipka. (D) Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l infuzije maline.

u sustavu peroksidaza-luminol-vodikov peroksid korelirao sa sadržajem triterpenskih spojeva. Međutim, u radu istih autora, u kojem je predmet proučavanja bila druga biljka, nisu uočili korelaciju OAE sa sadržajem bilo koje skupine tvari, uključujući flavonoide.

Takva odstupanja povezana su s najmanje tri čimbenika. Prije svega, važna je aktivnost antioksidansa, odnosno brzina njihove interakcije s radikalima, koja je različita za različite antioksidanse uključene u biljni uzorak. Prema Izmailovu, konstante brzine odgovarajućih reakcija za meksidol, tokoferol i kvercetin odnose se kao 0,04:2:60. Drugo, svaka molekula antioksidansa, ulazeći u kemijska reakcija, može presresti različite količine radikala. Prema radu, kvercetin, mokraćna i askorbinska kiselina presrele su 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 odnosno 0,5 ± 0,2 radikala po izreagiranoj molekuli antioksidansa (korišten je sustav hemin-H2O2-luminol). Treće, na rezultate studije mogla bi utjecati prisutnost aktivnosti peroksidaze u samim biljnim uzorcima, kao u radu, kao i prisutnost kalcija u uzorcima, koji je, kako je pokazano u radu, sposoban povećati aktivnost peroksidaze hrena pod određenim uvjetima. To obično dovodi do više

veći intenzitet CL na platou nego na kontrolnim krivuljama, što međutim nismo uočili.

Prvi čimbenik oštro ograničava korištenje takvog parametra kao što je promjena sume svjetlosti, budući da vrijeme mjerenja kemiluminiscencije mora biti duže od vremena potrošnje svih antioksidansa u ispitnom uzorku. O pojavi ovog trenutka može se prosuditi samo mjerenjem kinetike kemiluminiscencije. Osim toga, doprinos slabih antioksidansa OAU-u oštro je podcijenjen, budući da je vrijeme njihove potpune oksidacije višestruko dulje od prihvatljivog trajanja mjerenja (10-20 min).

Stehiometrijski koeficijent antioksidansa još je važniji. Broj radikala n koje on presreće jednak je

gdje je p stehiometrijski koeficijent, a Am promjena koncentracije antioksidansa tijekom vremena mjerenja, u našem slučaju početne koncentracije ispitivane tvari u ispitivanom uzorku.

Razlika u svjetlosnom zbroju luminiscencije u odsutnosti antioksidansa iu njegovoj prisutnosti proporcionalna je n. Ukupni broj presretnutih radikala jednak je n = Y.p. m,

gdje je stehiometrijski koeficijent pojedinog antioksidansa, a m njegova koncentracija tijekom mjerenja

Predmet istraživanja Flavonoidi, mg%* Tanini, mg%* Askorbinska kiselina, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. jedinice TAU, mg% kvercetina

Uvarak plodova oskoruše 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Uvarak od šipka 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Uvarak od plodova gloga 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infuzija suhih plodova maline 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Napomena: * - literaturni podaci, . AS - promjena svjetlosne sume za uzorak, rel. jedinice, C - koncentracija uzorka u kiveti, g/l. Izračunate vrijednosti pouzdane su na str<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

Rhenia. Ukupan broj presretnutih radikala svakako nije jednak ukupnoj količini antioksidansa, jer pt koeficijenti ne samo da nisu jednaki jedinici, već se značajno razlikuju za različite antioksidanse.

Vrijednost n proporcionalna je razlici u količinama svjetlosti izmjerenim tijekom određenog vremena između uzorka koji sadrži antioksidans i kontrolnog uzorka koji ne sadrži antioksidanse:

gdje je k koeficijent koji je konstantan pod istim uvjetima mjerenja.

Metoda o kojoj se govori u članku omogućuje određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta, dok kemijska analiza omogućuje određivanje ukupnog sadržaja antioksidansa u proizvodu. Stoga se čini da je metoda kemiluminiscencije informativnija od kemijskih analiza.

Uvjete za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih sirovina odabrali smo snimanjem kinetike kemiluminiscencije u sustavu peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola (koncentracije komponenata - 4 nM, 100 µM i 40 µM, respektivno; 20 mM fosfata pufer, pH 7,4 ),

osigurava oksidaciju jakih antioksidansa (askorbinska kiselina) i srednje jakih antioksidansa (kvercetin) u 10 minuta. Ovo trajanje mjerenja je prikladno i osigurava potrebnu kvalitetu mjerenja.

Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da su u ispitivanim objektima (dekocije plodova rowan, šipak, glog i infuzija plodova maline) glavni antioksidansi antioksidansi srednje snage, uključujući flavonoide, i slabe snage (tokoferol, itd.). Na temelju smanjenja sume kemiluminiscencije svjetlosti izračunat je ukupni antioksidativni kapacitet za ispitivane objekte. Usporedba dobivenih TAU vrijednosti s rezultatima kemijske analize pokazala je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima mogu razlikovati u sposobnosti učinkovite zaštite organizma od štetnog djelovanja slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih antioksidansa. Istodobno ga karakterizira jednostavnost i niska cijena istraživanja. Kombinacija mjerenja kinetike kemiluminiscencije s matematičkim modeliranjem reakcija omogućit će ne samo automatizaciju procesa određivanja TAU, već i određivanje doprinosa pojedinih skupina antioksidansa indikatoru.

Književnost

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. Slobodni radikali kao sudionici u regulatornim i patološkim procesima. U: Grigoriev A.I., Vladimirov Yu.A., urednici. Temeljne znanosti – medicina. Biophys. med. tehnol. M.: MAX Press; 2015. vol. 1. str. 38-71 (prikaz, ostalo).

3. Khasanov V.V., Ryzhova G.L., Maltseva E.V. Metode proučavanja antioksidansa. Chem. rast. sirovine. 2004.; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Butovska D. I., Trofimov A. V. Antioksidativna aktivnost kalkona. Kemiluminescentno određivanje reaktivnosti i kvantnokemijski proračun energija i struktura reagensa i intermedijera. Kinetika i kataliza. 2010.; 51 (4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Peroksi-

kemiluminiscencija posredovana radikalima: mehanička raznolikost i osnove za analizu antioksidansa. Arkivoc. 2007.; 8: 163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalskog kapaciteta kemiluminiscencijom luminola induciranom H2O2-heminom. J Agric Food Chem. 3. prosinca 2003.; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu, Proskurnina E. V. Slobodni radikali i stanična kemiluminiscencija. Uspekhi biol. kem. 2009.; 49: 341-88.

10. Vladimirov Yu., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Kinetička kemiluminiscencija kao metoda za proučavanje reakcija slobodnih radikala. Biofizika. 2011.; 56 (6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. Određivanje antioksidativne aktivnosti mjerenjem kinetike kemiluminiscencije. Fotobiologija i fotomedicina. 2011.; 7 (2): 70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Svjetljenje luminola izazvano termolizom 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropana). Bez

Radic Res Commun. 1992.; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O korištenju prigušivanja luminescencije luminola za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. lipnja 1994.; 16 (6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Procjena ukupnog antioksidativnog potencijala (TRAP) i ukupne antioksidativne reaktivnosti iz mjerenja kemiluminiscencije pojačane luminolom. Free Radic Biol Med. Veljača 1995.; 18 (2): 153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraživanje mehanizma luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog protoka. J Biol Chem. 25. rujna 1968.; 243 (18): 4706-14.

21. Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A. Određivanje antioksidansa aktiviranom kemiluminiscencijom pomoću 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Vestn. MGU. Ser. 2. Chem 2012;53(3): 187-93 (prikaz, ostalo).

24. Ministarstvo zdravstva SSSR Državna farmakopeja SSSR XI izd. Vol. 2 “Opće metode analize. Ljekovite biljne sirovine." M.: Medicina; 1987. str. 147-8 (prikaz, stručni).

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Studija pripravaka za ekstrakciju šipka. Ljekarna. 2012.; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Proučavanje plodova gloga različitim metodama konzerviranja i vodene ekstrakcije. Ljekarna. 2010.; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. Biološki aktivne tvari plodova i vodenih ekstrakata obične maline. Ljekarna. 2014.; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Proučavanje biološki aktivnih tvari plodova gloga - sirovine za pripremu homeopatskih matričnih tinktura. U subotu znanstveni tr. na temelju materijala iz XXIV Moskva. međunarodni homeopata. konf. “Razvoj homeopatske metode u suvremenoj medicini”; 24. – 25. siječnja 2014.; Moskva. M.; 2014. str. 146-7 (prikaz, stručni).

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Proučavanje sastava biološki aktivnih tvari u ljekovitim biljnim sirovinama različitih metoda konzerviranja. U subotu teze temeljene na materijalima iz XX. Ross. nacionalni kongr. „Čovjek i lijek“; 15. – 19. travnja 2013.; Moskva. M.: EKOOnis; 2013. str. 184-90 (prikaz, ostalo).

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Proučavanje aktivnosti peroksidaze u ekstraktima iz rizoma i korijena hrena i njegove stabilnosti na različite utjecaje. Vestn. Moskovsko državno sveučilište. Ser. 2. Chem. 2006.; 47 (5): 350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Svobodnye radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. U: Grigor'ev AI, Vladimirov YuA, urednici. Fundamental'nye nauki - medicinitsine. Biofizičke medicinske tehnologije. Moskva: MAKS Press; 2015. v. 1. str. 38-71 (prikaz, ostalo). Ruski.

2. Chanda S, Dave R. In vitro modeli za procjenu antioksidativne aktivnosti i neke ljekovite biljke koje posjeduju antioksidativna svojstva: pregled. Afr J Microbiol Res. prosinac 2009.; 3 (13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal'tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel'nogo Syr'ja. 2004; (3): 63-75. Russian.

4. Vasil"ev RF, K""ncheva VD, Fedorova GF, B""tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagentov i intermediatov. Kinetika i kataliza. 2010.; 51 (4): 533-41. Ruski.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioksidativni potencijal spojeva povezanih s kurkuminom proučavan kinetikom kemiluminiscencije, učinkovitosti prekida lanca, aktivnosti čišćenja (ORAC) i DFT izračunima. Beilstein J Org Chem. 11. kolovoza 2015.; 11: 1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Kemiluminiscencija posredovana peroksi radikalima: mehanička raznolikost i osnove za analizu antioksidansa. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF. Jednostavna kemiluminiscencijska analiza za antioksidativna svojstva biljnih lipida: osnove i ilustrativni primjeri. Analitičar. 2009. listopad; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Procjena antiradikalskog kapaciteta H2O2-heminom induciranim luminolom

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Svobodnye radikaly i kletochnaya hemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009.; 49: 341-88. Ruski.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya kak metod izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. Biofizika. 2011.; 56 (6): 1081-90. Ruski.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metoda izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologija i fotomedicina. 2011.; 7 (2): 70-6. Ruski.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminolna luminiscencija inducirana 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropan) termolizom. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O korištenju prigušivanja luminescencije luminola za procjenu aktivnosti SOD. Free Radic Biol Med. lipnja 1994.; 16 (6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Vidljiva kemiluminiscencija povezana s reakcijom između methemoglobina ili oksihemoglobina s vodikovim peroksidom. Photochem Photobiol. studeni 1994.; 60 (5): 405-11.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Procjena ukupnog antioksidativnog potencijala (TRAP) i ukupne antioksidativne reaktivnosti iz mjerenja kemiluminiscencije pojačane luminolom. Free Radic Biol Med. Veljača 1995.; 18 (2): 153-8.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. In vitro procjena antioksidativne aktivnosti liposomalnih flavonola sustavom HRP-H2O2-luminol. J Microencapsul. 2011.; 28 (4): 258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Istraživanje mehanizma

luminiscentne peroksidacije luminola tehnikama zaustavljenog protoka. J Biol Chem. 25. rujna 1968.; 243 (18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fitokemijske karakteristike, aktivnosti hvatanja slobodnih radikala i neuroprotekcija pet ekstrakata ljekovitih biljaka. Evid Based Complement Alternat Med. 2012.; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. kolovoza.

19. Chang CL, Lin CS. Fitokemijski sastav, antioksidativno djelovanje i neuroprotektivni učinak ekstrakata Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012.; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011, 5. srpnja.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Procjena antioksidativnog djelovanja različitih flavonoida kemiluminiscencijskom metodom. AAPS PharmSci. 2003.; 5 (2): 111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol"zovaniem 2,2"-azo-bis(2-amidinopropana). Chemistry Bulletin Moskovskog sveučilišta. 2012.; 53 (3): 187-93. Ruski.

22. Pogačnik L, Ulrih NP. Primjena optimiziranog kemiluminiscencijskog testa za određivanje antioksidativnog kapaciteta biljnih ekstrakata. Luminescencija. 2012. studeni-prosinac; 27 (6): 505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Ukupni antioksidansi niske molekularne težine kao sažeti parametar, kvantificiran u biološkim uzorcima testom inhibicije kemiluminiscencije. Nat Protoc. ruj 2010.; 5 (10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11. izd. br. 2. "Obshchie metody analiza."

Lekarstvennoe rastitel "noe syr"e". Moskva: Medltsina; 1987. str. 147-8. Ruski.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie extractionnykh preparatov shipovnika. Ljekarna. 2012.; (2): 14-6. Ruski.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmatsiya. 2010.; (5): 16-8. Ruski.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsiya. 2014.; (1): 8-10. Ruski.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr "ya za pripravleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Zbornik radova 14. Moskovske međunarodne homeopatske konferencije "Razvitie gomeopaticheskogo methoda v sovremennoi meditsine"; 2014. 24.-25. siječnja; Moskva M. ; 2014. str. 7. ruski .

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicalheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr"e razlichnykh sposobov konservatsii. Zbornik radova 20. Ruskog nacionalnog kongresa "Čelovek i lekarstvo"; 2013. travnja 1519.; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. str. 184-90 (prikaz, ostalo). Ruski.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktah iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil"nosti k razlichnym vozdeistviyam. Chemistry Bulletin Moskovskog sveučilišta. 2006; 47 (5): 350-2. Russian.

], međutim, definicija antioksidansa kao kemijskih spojeva ne daje potpunu sliku zaštitnih svojstava predmeta koji se proučava: ona su određena ne samo količinom određenog antioksidansa, već i aktivnošću svakog od njih. Antioksidativna aktivnost ili antioksidacijska aktivnost, AOA, konstanta je brzine reakcije antioksidansa sa slobodnim radikalom (kInH). Metoda kemiluminiscencije (CL) omogućuje određivanje ukupne količine radikala koji vežu antioksidanse u uzorku (ukupni antioksidativni kapacitet, TAU), a pri korištenju metode matematičkog modeliranja kinetike CL i brzinu stvaranja i reakcije radikala. s antioksidansima, odnosno AOA [, ,].

Najčešća modifikacija kemiluminiscencijske metode za određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta temelji se na upotrebi luminola kao aktivatora kemiluminescencije [, , ,]. Uzorak se stavlja u kemiluminometarsku kivetu uz dodatak luminola, vodikovog peroksida i spoja koji može stvarati radikale kao rezultat spontane razgradnje (termolize), na primjer 2,2'-azobis-(2-amidinopropan) dihidroklorida (ABAP). ): ABAP → 2R. U prisutnosti molekulskog kisika, alkilni radikal R tvori peroksilni radikal ROO: R + O 2 → ROO. Zatim peroksilni radikal oksidira kemiluminiscentnu sondu luminol (LH 2) i nastaje luminol radikal (LH): ROO + LH 2 → ROOH + LH. Iz LH, stvaranjem intermedijarnih tvari (luminol hidroperoksida i luminol endoperoksida), nastaje u elektronički pobuđenom stanju molekula konačnog produkta oksidacije luminola, aminoftalne kiseline, koja emitira foton, a kao rezultat toga dolazi do kemiluminiscencije. . Intenzitet CL-a proporcionalan je brzini proizvodnje fotona, a ona je pak proporcionalna stacionarnoj koncentraciji LH u sustavu. Interakcijama s radikalima antioksidansi prekidaju opisani lanac transformacija i sprječavaju nastanak fotona.

Spojevi podložni termolizi nisu jedini mogući izvor radikala pri analizi antioksidativnog kapaciteta uzorka kemiluminiscentnom metodom. Alternative su sustavi peroksidaza hrena–vodikov peroksid [, ], hemin–vodikov peroksid, citokrom S–kardiolipin–vodikov peroksid itd. Reakcijska shema oksidacije luminola peroksidazama razmatrana je u radu Cormiera i sur. .

Kinetičke krivulje CL za ove sustave odražavaju dva stupnja reakcije: stupanj povećanja intenziteta CL i stupanj platoa ili postupnog opadanja luminiscencije, kada je intenzitet CL ili konstantan ili polagano opada. U radu su opisana dva pristupa mjerenju ukupnog antioksidativnog kapaciteta koji uzimaju u obzir ovu značajku krivulja. Metoda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) temelji se na mjerenju latentnog razdoblja CL τ i mogu se koristiti za određivanje antioksidansa kao što su Trolox ili askorbinska kiselina: karakterizira ih visoka konstanta brzine reakcije s radikalima i zbog toga se mogu nazvati jakim antioksidansima. Tijekom latentnog razdoblja dolazi do njihove potpune oksidacije. TAR (Total Antioxidant Reactivity) metoda mjeri stupanj gašenja kemiluminiscencije q na platou ili maksimumu krivulje kemiluminiscencije: formula, gdje je I intenzitet kemiluminiscencije bez antioksidansa, a I 1 je intenzitet CL u prisutnosti antioksidansa. Ova metoda se koristi ako sustav sadrži pretežno slabe antioksidanse s niskim konstantama brzine interakcije s radikalima - puno nižim u usporedbi s konstantom luminola.

Učinak antioksidansa karakteriziraju ne samo pokazatelji τ I q. Kao što se može vidjeti iz radova [,], učinak antioksidansa poput mokraćne kiseline u sustavu hemin–H 2 O 2 –luminol ili tokoferola, rutina i kvercetina u sustavu citokroma S–kardiolipin–H 2 O 2 –luminol, karakteriziran promjenom maksimalne stope porasta CL ( vmax). Kao što pokazuju rezultati matematičkog modeliranja kinetike, vrijednosti konstanti brzine interakcije ovih antioksidansa s radikalima bliske su vrijednosti konstante luminola, stoga se takvi antioksidansi mogu nazvati antioksidansima srednje jakosti.

Ako je materijal koji se proučava, posebno biljne sirovine, sadržavao samo jednu vrstu antioksidansa, tada bi se njihov sadržaj mogao karakterizirati jednim od tri gore navedena pokazatelja ( τ , q ili vmax). Ali biljni materijali sadrže mješavinu antioksidansa različite jačine. Za rješavanje ovog problema neki su autori [ , , , ] koristili promjenu svjetlosne sume kemiluminiscencije tijekom određenog vremena ∆S, izračunatu formulom , gdje je ∆ S 0 i ∆ S S- CL svjetlo sumi za određeno vrijeme t u kontrolnom odnosno ispitnom uzorku. Vrijeme mora biti dovoljno da oksidiraju svi antioksidansi u sustavu, odnosno da CL krivulja ispitnog uzorka dosegne razinu CL krivulje kontrolnog uzorka. Potonji pretpostavlja da istraživači moraju ne samo zabilježiti svjetlosnu sumu sjaja, već i zabilježiti kinetičku krivulju CL-a dovoljno dugo, što nije uvijek učinjeno.

Budući da svi izmjereni pokazatelji ovise o uređaju i uvjetima mjerenja, antioksidativni učinak tvari u sustavu koji se proučava obično se uspoređuje s učinkom antioksidansa koji se uzima kao standard, na primjer Trolox [,].

Mnogi su autori koristili sustav peroksidaza hrena – vodikov peroksid za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih materijala. U radovima [ , ] za procjenu količine antioksidansa u uzorcima korišten je latentni period CL (TRAP metoda), a u radovima [ , , ] - površina ispod krivulje razvoja CL. Međutim, navedeni radovi ne daju jasno obrazloženje za izbor jednog ili drugog parametra za procjenu OAU-a.

Svrha istraživanja bila je utvrditi kako omjer različitih vrsta antioksidansa utječe na TOA, te modificirati metodu kemiluminiscencije na način da se točnije odredi TOA u biljnom materijalu. Da bismo to učinili, postavili smo si nekoliko zadataka. Prvo, usporedite CL kinetiku proučavanih objekata s kinetikom standardnih antioksidansa tri vrste (jaki, srednji i slabi) kako biste razumjeli koji tip antioksidansa daje glavni doprinos OAU proučavanih objekata. Drugo, izračunajte OAE objekata koji se proučavaju mjerenjem smanjenja sume svjetla CL pod utjecajem tih objekata u usporedbi s učinkom antioksidansa koji daje najveći doprinos OAE.

MATERIJALI I METODE

Predmet istraživanja bili su industrijski uzorci gloga, borovca ​​i šipka koje proizvodi JSC Krasnogorskleksredstva (Rusija), kao i plodovi malina koje su autori sakupili u moskovskoj regiji u prirodnim uvjetima rasta i sušeni na temperaturi od 60–80 ° C dok ne prestanu ispuštati sok i deformirati se pri pritisku.

Reagensi za analizu antioksidativnog kapaciteta kemiluminiscentnom metodom bili su: KH 2 PO 4, 20 mM otopina pufera (pH 7,4); peroksidaza iz korijena hrena (aktivnost 112 jedinica/mg, M = 44173,9), 1 mM vodena otopina; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazindion, hidrazid 3-aminoftalne kiseline, M = 177,11), 1 mM vodena otopina; vodikov peroksid (H202, M = 34,01), 1 mM vodena otopina; otopine antioksidansa (askorbinska kiselina, kvercetin, tokoferol). Sve reagense proizvodi Sigma Aldrich (SAD).

Uvarci od plodova gloga, rowan i šipka i infuzija plodova maline pripremljeni su prema metodama Državne farmakopeje SSSR-a, navedenim u općem farmakopejskom članku "Infuzije i dekocije".

Određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta provedeno je snimanjem kemiluminiscencije na kemiluminometru Lum-100 (DISoft, Rusija) pomoću softvera PowerGraph 3.3. Za određivanje OAE u biljnom materijalu potrebno je 40 μl luminola u koncentraciji od 1 mM, 40 μl peroksidaze hrena u koncentraciji od 0,1 μM, od 10 do 50 μl dekokta ili infuza (ovisno o koncentraciji) i fosfatni pufer u Potrebna količina stavljena je u kivetu uređaja da bi se ukupni volumen uzorka doveo do 1 ml. Kiveta je postavljena u uređaj i CL je snimljen, promatrajući pozadinski signal. Nakon 48 s snimanja pozadinskog signala, u kivetu je dodano 100 μl H2O2 u koncentraciji od 1 mM i CL snimanje je nastavljeno 10 minuta. Pripremljena su četiri uzorka s različitim koncentracijama svakog biljnog objekta. CL je također zabilježen za otopine askorbinske kiseline, kvercetina i tokoferola u pet različitih koncentracija za svaki antioksidans. Naknadno je OAU uzoraka dekocija i infuzija preračunat u kvercetin.

Koncentracije luminola, peroksidaze hrena i vodikovog peroksida odabrane su tako da se odredi antioksidativni kapacitet vodenih ekstrakata ljekovitog bilja u prihvatljivom vremenu (ne dužem od 10 min). Tijekom tog vremena krivulje kemiluminiscencije za antioksidanse askorbat i flavonoid kvercetin (glavni antioksidansi biljnih materijala) dosegle su plato, što ukazuje na potpuno uništenje antioksidansa u sustavu. Razrjeđenja ispitivanih uzoraka i koncentracije otopina standardnih antioksidansa (naznačenih u legendama uz slike) odabrane su na način da su sve CL kinetičke krivulje mjerene pri istoj osjetljivosti uređaja.

Antioksidativni kapacitet izračunat je iz promjene površine (∆ S) ispod kinetičke krivulje kemiluminiscencije (zbroj svjetlosti) pri dodavanju tvari koja sadrži antioksidans. U tu svrhu izračunali smo S 0 za sustav bez antioksidansa i od njega oduzeo površinu S S, karakterizirajući sustav u koji je dodan antioksidans. Vrijednost ∆ S ovisi o osjetljivosti kemiluminometra i uvjetima mjerenja. Omjer ∆ S/C V(Gdje C- koncentracija biološkog materijala koji se proučava u kiveti, g/l, i V- volumen kivete, l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g ispitivanog materijala, odnosno biljnih sirovina.

Na sličan način izračunat je i antioksidativni kapacitet ∆ S A otopina standardnog antioksidansa, na primjer kvercetina, stavljena u isti volumen reakcijske smjese. Omjer ∆ S A / C A V(Gdje C A- težinska koncentracija antioksidansa u kiveti, g/l) izražava antioksidativni kapacitet 1 g antioksidansa.

Za svaki od standardnih antioksidansa zabilježen je signal iz otopina nekoliko koncentracija kako bi se osiguralo da su izračuni unutar linearnog odnosa i da su dobiveni rezultati ponovljivi. Doista, dobivena je linearna ovisnost (∆ S A = k A C A) signal iz koncentracije iz koje je izračunat stehiometrijski koeficijent k A. Prema Fisherovom kriteriju, vrijednosti dobivene za standardne antioksidanse k A statistički značajno s vjerojatnošću 0,975. Zatim je za svaki od četiri biljna uzorka snimljen signal iz četiri koncentracije, te je za sve uzorke dobivena linearna ovisnost signala o koncentraciji (∆ S = k·C), iz čega je izračunat stehiometrijski koeficijent k. Uz vjerojatnost od 0,975 (Fisherov test), k vrijednosti dobivene za uzorke biljaka su statistički značajne. Ukupni antioksidativni kapacitet biljnog materijala u odnosu na masu standardnog antioksidansa (mg%) određen je pomoću formule.

Vrijednosti su predstavljene kao aritmetička sredina ± standardna devijacija (M ± δ) na p

REZULTATI ISTRAŽIVANJA

Proučavanje kinetike kemiluminiscencije u prisutnosti natrijeva askorbata (Sl. 1. Učinak natrijeva askorbata na kinetiku kemiluminiscencije" data-note="Koncentracije komponenti sustava: luminol - 40 µM, peroksidaza hrena - 4 nM, vodikov peroksid - 100 µM. Krivulje: 1 - kontrolni uzorak; 3 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM natrijev askorbat. potpuno potisnuto.. Njegovo trajanje je proporcionalno količini antioksidansa u sustavu. Pritom se ne mijenja ni nagib CL krivulja ni intenzitet CL antioksidans koji presreće sve nastale radikale u sustavu, uključujući luminolne radikale, a CL se ne razvija sve dok se sav askorbat ne oksidira.

Drugi su istraživači također pokazali da se rezultati kemijske analize i TAU vrijednosti određene kemiluminiscentnom metodom često ne poklapaju. U radu je određen ukupni antioksidativni kapacitet u sustavu peroksidaza–luminol–vodikov peroksid u korelaciji sa sadržajem triterpenskih spojeva. Međutim, u radu istih autora, u kojem je predmet proučavanja bila druga biljka, nisu uočili korelaciju OAE sa sadržajem bilo koje skupine tvari, uključujući flavonoide.

Takva odstupanja povezana su s najmanje tri čimbenika. Prije svega, važna je aktivnost antioksidansa, odnosno brzina njihove interakcije s radikalima, koja je različita za različite antioksidanse uključene u biljni uzorak. Prema Izmailovu, konstante brzine odgovarajućih reakcija za meksidol, tokoferol i kvercetin koreliraju kao 0,04:2:60. Drugo, svaka molekula antioksidansa, ulazeći u kemijsku reakciju, može presresti različiti broj radikala. Prema radu, kvercetin, mokraćna i askorbinska kiselina presrele su 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 odnosno 0,5 ± 0,2 radikala po izreagiranoj molekuli antioksidansa (korišten je sustav hemin–H 2 O 2 -luminol). Treće, na rezultate studije mogla bi utjecati prisutnost aktivnosti peroksidaze u samim biljnim uzorcima, kao u radu, kao i prisutnost kalcija u uzorcima, koji je, kako je pokazano u radu, sposoban povećati aktivnost peroksidaze hrena pod određenim uvjetima. To obično uzrokuje veći intenzitet CL na platou nego na kontrolnim krivuljama, što, međutim, nismo uočili.

Prvi čimbenik oštro ograničava korištenje takvog parametra kao što je promjena sume svjetlosti, budući da vrijeme mjerenja kemiluminiscencije mora biti duže od vremena potrošnje svih antioksidansa u ispitnom uzorku. O pojavi ovog trenutka može se prosuditi samo mjerenjem kinetike kemiluminiscencije. Osim toga, doprinos slabih antioksidansa TAU-u oštro je podcijenjen, budući da je vrijeme njihove potpune oksidacije višestruko dulje od prihvatljivog trajanja mjerenja (10-20 min).

Stehiometrijski koeficijent antioksidansa još je važniji. Broj radikala n presretnut njime jednak je , gdje je ρ je stehiometrijski koeficijent, a ∆ m- promjena koncentracije antioksidansa tijekom mjerenja, u našem slučaju - početne koncentracije ispitivane tvari u ispitivanom uzorku.

Razlika u svjetlosnom zbroju luminiscencije u odsutnosti antioksidansa i u njegovoj prisutnosti proporcionalna je n. Ukupan broj presretnutih radikala je , gdje je ρ i je stehiometrijski koeficijent specifičnog antioksidansa, i m i- njegova koncentracija tijekom mjerenja. Ukupan broj presretnutih radikala očito nije jednak ukupnoj količini antioksidansa, budući da koeficijenti ρ i ne samo da nisu jednaki jedinici, već se i značajno razlikuju za različite antioksidanse.

Veličina n proporcionalan je razlici u količinama svjetlosti izmjerenim tijekom određenog vremena između uzorka koji sadrži antioksidans i kontrolnog uzorka koji ne sadrži antioksidanse: S = k n, Gdje k- koeficijent, konstantan pod istim uvjetima mjerenja.

Metoda o kojoj se govori u članku omogućuje određivanje ukupnog antioksidativnog kapaciteta, dok kemijska analiza omogućuje određivanje ukupnog sadržaja antioksidansa u proizvodu. Stoga se čini da je metoda kemiluminiscencije informativnija od kemijskih analiza.

Uvjeti koje smo odabrali za procjenu ukupnog antioksidativnog kapaciteta biljnih sirovina snimanjem kinetike kemiluminiscencije u sustavu koji se sastoji od peroksidaze hrena, vodikovog peroksida i luminola (koncentracije komponenata - 4 nM, 100 µM i 40 µM, respektivno; 20 mM fosfata pufer, pH 7,4), osigurao je oksidaciju jakih antioksidansa (askorbinska kiselina) i srednje jakih antioksidansa (kvercetin) u 10 minuta. Ovo trajanje mjerenja je prikladno i osigurava potrebnu kvalitetu mjerenja.

Analiza kinetike kemiluminiscencije pokazala je da su u ispitivanim objektima (dekocije plodova rowan, šipak, glog i infuzija plodova maline) glavni antioksidansi antioksidansi srednje snage, uključujući flavonoide, i slabe snage (tokoferol, itd.). Na temelju smanjenja sume kemiluminiscencije svjetlosti izračunat je ukupni antioksidativni kapacitet za ispitivane objekte. Usporedba dobivenih TAU vrijednosti s rezultatima kemijske analize pokazala je da se proizvodi koji sadrže istu količinu antioksidansa s različitim omjerima mogu razlikovati u sposobnosti učinkovite zaštite organizma od štetnog djelovanja slobodnih radikala. Opisana tehnika je obećavajuća za proučavanje biljnih objekata koji sadrže mješavinu različitih antioksidansa. Istodobno ga karakterizira jednostavnost i niska cijena istraživanja. Kombinacija mjerenja kinetike kemiluminiscencije s matematičkim modeliranjem reakcija omogućit će ne samo automatizaciju procesa određivanja TAU, već i određivanje doprinosa pojedinih skupina antioksidansa indikatoru.

Klikom na gumb "Preuzmi arhivu" potpuno besplatno preuzimate potrebnu datoteku.
Prije preuzimanja ove datoteke sjetite se onih dobrih eseja, testova, seminarskih radova, teze, članke i druge dokumente koji leže nezatraženi na vašem računalu. Ovo je vaš rad, treba sudjelovati u razvoju društva i koristiti ljudima. Pronađite ove radove i pošaljite ih u bazu znanja.
Mi i svi studenti, diplomanti, mladi znanstvenici koji koriste bazu znanja u svom studiranju i radu bit ćemo vam jako zahvalni.

Za preuzimanje arhive s dokumentom unesite peteroznamenkasti broj u polje ispod i kliknite gumb "Preuzmi arhivu"

Slični dokumenti

Proučavanje enzimatskih i neenzimatskih putova stvaranja reaktivnih spojeva kisika. Mehanizmi njihovog štetnog djelovanja na žive stanice, posebice inicijacija lipidne peroksidacije slobodnih radikala. Antioksidativna zaštita organizma.

kolegij, dodan 01.11.2017


Antioksidativno djelovanje biljnih materijala. Opis biljaka s antioksidativnim djelovanjem. Određivanje sadržaja vitamina C u viburnum vulgaris tijekom razdoblja zrenja, sadržaj polifenolnih spojeva u raznim vrstama čajeva.

diplomski rad, dodan 02.04.2009


Giberelini su široka klasa fitohormona koji reguliraju rast i razvoj: povijest otkrića, kemijska struktura, klasifikacija, sadržaj u biljkama. Biokemija, regulacijske funkcije i biološka aktivnost giberelina, njihova struktura, svojstva.

prezentacija, dodano 20.10.2014


sažetak, dodan 19.05.2017


Biološka aktivnost i kemijska struktura brasinosteroida. Sinteze uz očuvanje ugljikovog skeleta. Stvaranje funkcija karakterističnih za ciklički dio brasinosteroida. Izgradnja bočnog lanca sa stvaranjem novih ugljik-ugljik veza.

kolegij, dodan 07.12.2014


Proučavanje fiziologije gušterače, uloga pankreasnog soka u probavnom procesu. Analiza reaktivnih kisikovih spojeva i putova njihova nastanka, biokemija slobodnih radikalskih procesa. Prikaz stanja metaboličkih procesa u akutnom pankreatitisu.

kolegij, dodan 03/10/2012


Kemijski sastav rod Penstemon i biološka aktivnost. Kvalitativna fitokemijska analiza biljnih sirovina tankoslojnom kromatografijom. Određivanje kvantitativnog sastava komponenata tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti.

praktični rad, dodano 07.01.2016